Investigacion del proceso de diferenciacion celular en tiempo real e in situ. Bacillus thuringiensis como sistema modelo

Abstract

Durante el ciclo de vida de Bacillus thuringiensis se presentan tres fases: la de crecimiento exponencial, la de transición y la de esporulación. Para formar la espora y sintetizar delta-endotoxinas durante la fase de esporulación, la bacteria lleva a cabo un proceso de diferenciación celular que inicia durante la fase de transición. El proceso de diferenciación celular tiene importantes repercusiones en distintas ramas de la ciencia y la tecnología, por lo que su estudio en línea es de gran interés para el ser humano. La espectroscopia de impedancia es una técnica que puede permitir un monitoreo continuo e in situ del estado celular en un cultivo. Durante este proyecto se evaluaron con esta técnica: medios de cultivo, sobrenadantes de fermentación, esporas en solución, sales minerales del medio de cultivo así como cultivos celulares de B. thuringiensis, todo para establecer bases de estudio y seguir el proceso de diferenciación celular en tiempo real e in situ. Adicionalmente, se establecieron cultivos por lote a diferentes condiciones y se realizaron escaneos de 200 frecuencias de 42 Hz a 5 MHz aplicando corriente y voltaje fijos de 20 mA y 5 V DC respectivamente. Las respuestas de las señales dieléctricas adquiridas fueron Impedancia (Z), Angulo de fase (Deg), Voltaje (V), Capacitancia (Cs), Factor de disipación (D), Corriente (I), Conductancia (G), Reactancia (X) y Resistencia (R) las cuales se correlacionaron con las diferentes fases de crecimiento establecidas con datos del crecimiento celular, expresión del gen cry1Ac, consumo de glucosa, oxígeno disuelto, dióxido de carbono, pH, temperatura y esporas libres obtenidas con técnicas convencionales y parámetros de fermentación. En base a estas correlaciones, las frecuencias de 0.1, 0.5 y 1.225 MHz fueron seleccionadas para medir las propiedades dieléctricas en cultivos por lote independientes a una frecuencia fija. Reactancia y Resistencia mostraron un mejor comportamiento relacionado a fase de crecimiento exponencial, fase de transición, fase de esporulación y liberación de esporas debido la respuesta de las señales principalmente utilizando la frecuencia de 1.225 MHz, la cual también se aplicó a cultivos por lote alimentado. Interesantemente, estos perfiles tuvieron cambios particulares durante fase de crecimiento exponencial y fase de transición, cambios que no son identificados por métodos convencionales, pero fueron relacionados con el inicio del proceso de diferenciación celular del B. thuringiensis. ABSTRACT: During life cycle of Bacillus thuringiensis presents three phases: exponential phase, transition state and sporulation phase. In order to form a dormant spore and to synthesize delta-endotoxins during sporulation phase, bacteria must undergo a cellular differentiation process initiated during the transition state. The process of cell differentiation process has important implications in various branches of science and technology, so its online study is of great interest to humans. Impedance spectroscopy, is a technique that can allow continuous and in situ monitoring of the cellular state in a culture. During this project were evaluated with this technique: culture media, fermentation supernatants, spores in solution, mineral salts of medium and cell cultures of B. thuringiensis, all to establish baseline study and follow the process of cell differentiation in real time and in situ. Additionally, we conducted batch cultures under different conditions, by scanning 200 frequencies from 42 Hz to 5 MHz applying fixed current and voltage of 20 mA and 5 V DC, respectively. The responses of dielectric signals acquired were Impedance (Z), Angle phase (Deg), Voltage (V), Capacitance (Cs), Dissipation factor (D), Current (I), Conductance (G), Reactance (X) and Resistance (R) which were correlated with the different growth phases established using data from cellular growth, cry1Ac gene expression, glucose consume, dissolved oxygen, carbon dioxide, pH, temperature and free spores obtained with conventional techniques and fermentation parameters. Based on these correlations, frequencies of 0.1, 0.5 and 1.225 MHz were selected for the purpose of measuring dielectric properties in independent batch cultures at a fixed frequency. Reactance and Resistance manifest more propitious behavior in relation to exponential growth phase, transition state, sporulation phase and spore release due to response of their signals mainly using 1.225 MHz frequency that was also applied to fed-batch cultures. Interestingly, these profiles underwent pronounced changes during exponential growth phase and transition state that were not noticed when using conventional methods, but were indicative of the beginning of the B. thuringiensis cell differentiation process.