Evaluación de los cambios moleculares que ocurren durante la desecación- rehidratación de Pseudomonas putida KT2440

Abstract

El potencial de Pseudomonas putida KT2440 para actuar como un promotor del crecimiento de plantas o como un biorremediador de compuestos tóxicos puede verse afectado por la desecación. En el presente trabajo, se evaluó la tasa de supervivencia bacteriana (BSR) de P. putida KT2440 bajo estrés por desecación en presencia de diferentes protectores. La BSR en presencia de disacáridos no reductores, como la trehalosa, fue elevada después de 15 días de desecación, mientras que en ausencia de protector no se detectó la presencia de bacterias. El kit LIVE/DEAD mostró que las bacterias protegidas con trehalosa mantuvieron un mayor número de células verdes después de la desecación, mientras que células sin protección se observaron de color rojo, indicando daño en la membrana. Sin embargo, cuando las bacterias no protegidas sometidas a 18 días de desecación se rehidrataron por un corto tiempo con exudados rizosfericos de maíz o por 48 h con agua (rehidratación prolongada), el número de bacterias fue tan elevado como en células sin estrés, sugiriendo que las células entraron en estado viable no cultivable (VBNC) bajo estrés por desecación y regresaron al estado cultivable después de la rehidratación. Interesantemente, se observó un aumento en la intensidad del color verde de células que regresaron al estado cultivable (kit LIVE/DEAD), indicando una recuperación de la integridad de la membrana. Se determinó la actividad celular en el estado VBNC analizando la expresión de los genes 16S rRNA, rpoN (housekeeping), mutL, mutS (proteínas del sistema mismatch de reparación de DNA) y oprH (proteína de membrana externa) mediante RT-PCR, observando que todos los genes se expresaron en células cultivables y no cultivables, indicando procesos moleculares activos durante el estado VBNC. Se identificaron 12 genes relacionados con la tolerancia a desecación de P. putida KT2440 usando al estado VBNC como estrategia para enfrentar el estrés, 6 de los genes fueron sobre-expresados durante esta condición, proponiendo que los genes relacionados con el transporte activo (PP_2676, PP_0880 y PP_1446) podrían ayudar a la detoxificación celular durante la desecación, así como tener una línea de defensa en contra del estrés oxidativo (PP_0256), dos de los genes aún no se conoce su función (PP_3451 y PP_2662), sin embargo, podrían tener un papel relevante en la entrada y salida del estado VBNC; el resto de genes identificados en cepas mutantes de P. putida KT2440 (murC, PP_2106, , oprD, PP_2107 y PP_4252) no perdieron cultivabilidad como la cepa silvestre por lo que pueden estar involucrados en la entrada al estado VBNC. Dos proteínas fueron identificadas durante el estado VBNC TufB que podría estar favoreciendo la adaptación de las células al estrés a participando no sólo al participar en síntesis de proteínas específicas sino también en el aumento general de la traducción de proteínas necesarias para enfrentar el estrés; GroEL podría favorecer en la estabilización de proteínas evitando plegamientos erróneos que pudieran ocurrir durante la desecación. Una de las características identificadas en esta investigación es la disminución en la cantidad de DNA de células desecadas respecto a células antes del estrés, así como, el aumento del Cis-10-ácido heptadecenoico en células con 18 días de desecación tanto en rehidratación corta como en rehidratación prolongada.