Caracterización de los mecanismos de antagonismo que emplea Bacillus cereus seleccionado para el control de Fusarium verticillioides

Abstract

Sinaloa se ubica como el principal estado productor de maíz en México, produciendo aproximadamente 3, 686, 000 toneladas en el 2014. La producción nacional de maíz ha venido en aumento en los últimos cinco años; de 17, 566,000 toneladas cosechadas en 2011, la producción pasó a 24, 946, 000 toneladas en 2015, situándose Sinaloa con rendimientos de productividad por encima de la media nacional (SIAP-SAGARPA, www.siap.gob.mx). Entre las enfermedades del maíz más importantes están las pudriciones de mazorcas y tallos. Fusarium graminearum y F. verticillioides son los patógenos fúngicos más comunes asociados a maíz (Butrón et al., 2015). Morales-Rodríguez (2007) reportó a siete especies de Fusarium asociadas a la pudrición de la mazorca en los Valles Altos de México; al igual que en otras partes del mundo, F. verticillioides fue la especie más importante. Fusarium verticillioides (Saccardo) Neirenberg (Sinónimo, F. moniliforme Sheldon; teleomorfo, Gibberella moniliformis) es la especie de hongo más común que infecta a maíz causando la pudrición de la mazorca y del tallo (Butrón et al., 2015). F. verticillioides es el responsable de importantes pérdidas económicas a nivel mundial desde su aparición en los campos de maíz. La infección del maíz por F. verticillioides se puede presentar de diferentes maneras, una de éstas puede ser sistémica a través de las semillas, en el tallo y raíces, causando la pudrición de la totalidad de la planta (Nelson, 1992). Además, este hongo produce un grupo de micotoxinas llamadas fumonisinas, las cuales contaminan el maíz y los productos obtenidos de este cereal y que son causantes de daños a la salud humana (Picot et al., 2012). La rentabilidad del cultivo se basa en el monocultivo intensivo en el estado de Sinaloa, a consecuencia de esto se han propiciado las condiciones necesarias para la proliferación de enfermedades que representan un alto riesgo para el cultivo. La junta local de Sanidad Vegetal del valle del Fuerte (JLSVVF) realizó un monitoreo en lotes del norte de Sinaloa que mostraban los sintomas caracteristicos de Fusariosis enfocado a determinar el agente causal de esta sintomatología, esto fue durante los ciclos otoño- invierno (OI) 2006-2007 y primavera-verano (PV) 2007. Se identificó a F. oxysporum mediante claves taxonómicas como el agente casual, siendo detectado en 84% de las parcelas en el ciclo OI y 70 % de las parcelas en el ciclo PV. La severidad reportada fue mayor en el ciclo PV donde el 32 % de las plantas fueron dañadas en comparación con el 13 % de plantas dañadas en el ciclo OI. La sintomatología que presentaron las plantas afectadas fue pudrición en el tallo, marchitez, amarillamiento en hojas inferiores, poco crecimiento y otros. Estos hallazgos sugieren que el patógeno se encuentra ampliamente distribuido en el norte de Sinaloa, en los municipios de Ahome, El fuerte y Choix (Quintero-Benítez y Apodaca-Sánchez, 2008). En respuesta a esto, la JLSVVF sugirió que esta enfermedad iba en aumento y se tenían que tomar medidas de prevención y emplear estategias de control proponiendo un manejo integral mediante rotación de cultivos, fungicidas, hibridos resistentes y el uso de microoganismos antagonistas (Quintero-Benítez y Apodaca-Sánchez, 2008). En un estudio previo en nuestro grupo se describieron 161 aislados de los cuales 117 han sido identificados a la fecha como F. verticillioides (Fv) asociados a la presencia de fusariosis en maíz, a partir de semillas y raíz y se describieron otras tres especies F. nygamai, F. andiyazi y F. thapsinum (Leyva-Madrigal et al., 2015). Con esto se sugiere que en Sinaloa, a la fusariosis se asocian diferentes especies de Fusarium que afectan la producción de maíz en Sinaloa. En conjunto, los datos muestran que en la fusariosis más de una especie de Fusarium puede intervenir y ubicarse éstas de manera diferencial en la planta infectando raíz (Fv), tallo (Fo) o mazorca (Fv) (Leyva-Madrigal et al., 2015). En trabajo previo de nuestro grupo de trabajo se identificaron molecularmente tres aislados como F. verticillioides (se utilizaron 5 marcadores moleculares los cuales fueron: el ITS del ADN ribosomal, el gen de la calmodulina (Ver y CI), β-tubulina e histona-3) (Leyva-Madrigal et al., 2015; Figueroa-López et al., 2016). Uno de los tres aislados fúngicos fue seleccionado para pruebas de antagonismo de potenciales bacterias antagónicas a este hongo. La selección se realizó en un ensayo en líquido evaluando la capacidad antagónica hacia este hongo a partir de 11, 520 aislados correspondientes a una colección de bacterias proveniente de la rizósfera del maíz y se seleccionaron 622 aislados como posibles antagonistas. Despues de varias pruebas de selección, se obtuvieron 14 aislados bacterianos que fueron analizados en los híbridos de maíz Cebú y Garañón (Asgrow) (Figueroa-López et al., 2016). A partir de éstas pruebas se seleccionaron tres aislados pertenecientes al género Bacillus, siendo el aislado Bacillus cereus sensu lato B25 el que mejor funcionó en las variedades de maiz analizadas tanto en estudios de laboratorio e invernadero, como en campo (Lizárraga- Sánchez et al., 2015; Figueroa-López et al., 2016). Este aislado presentó diferentes mecanismos de promoción de crecimiento analizados en el laboratorio como la producción de agentes quelantes (sideróforos), enzimas proteolíticas, enzimas celulolíticas y la más importante relacionada con la inhibicion de hongos patógenos, enzimas quitinolíticas o quitinasas (Figueroa-López et al., 2016). La producción de enzimas hidrolíticas lo hace un potencial agente de bioncontrol contra hongos patógenos (Bressan and Fontes-Figueiredo, 2010). Estas enzimas son empleadas por una gran variedad de bacterias rizosféricas y representan una via por la cual las plantas se ven beneficiadas debido a la inhibición de hongos patógenos o por la inducción de resistencia sistémica (Slimene et al., 2015). Las quitinasas han ganado interés recientemente y se utilizan para diferentes aplicaciones biotecnológicas (Karthik et al., 2014). La búsqueda y el uso de estas enzimas va en aumento y existe un gran interés por incrementar su producción, los métodos de biología molecular estan siendo explotados para tener una fuente de quitinasas estable mediante el mejoramiento de microorganismos al introducirle modificaciones en su contenido genético para que las produzcan en mayor proporción (Karthik et al., 2014). Desde hace décadas se ha venido trabajando en tratar de incrementar la capacidad de los microorganismos para producir estas enzimas. Una amplia variedad de sistemas de expresión se ha desarrollado para la producción y clonación de genes pertenecientes a otros organismos (Felse and Panda, 1999). La tecnología del ADN recombinante permitió elaborar construcciones aislando la secuencia codificante de las quitinasas e insertarlas en bacterias reingenieradas para una eficiente expresión con alto rendimiento en la cantidad de proteína producida para evaluar su actividad antifúngica (Pan et al., 2006). Estas enzimas se han utilizado para modificar plantas y sobre-expresar estas enzimas quitinolíticas, insertándoles genes de quitinasas pertenecientes a hongos micoparasíticos y hacerlas tolerantes o completamente resistentes a patógenos fúngicos (Lorito et al., 1998). En este trabajo se estudia el posible papel de las quitinasas de Bacillus cereus B25 en la inhibición de Fusarium verticillioides como principal mecanismo de antagonismo. Se analiza mediante técnicas moleculares los niveles de transcrito de los dos genes implicados en la producción de esta enzima inducidos con lisado fúngico y quitina coloidal, así como también la actividad quitinolítica extracelular. Se realizó también la caracterización parcial de estas dos enzimas mediante su producción recombinante en E. coli y el patrón de colonización de Bacillus cereus B25 en plantas de raíces de maíz. El conocer el mecanismo de esta bacteria con el cual ejerce efecto antagónico sobre este patógeno, aportará información que se puede utilizar a futuro como uno de los criterios a considerar para la formulación de un producto agrobiológico que contenga una cepa con las características necesarias para combatir este patógeno en maíz. Adicionalmente, éste conocimiento puede llevarnos a formulaciones a partir de ésta cepa que puedan emplearse para el control de éste u otros hongos fitopatógenos en otros cultivos además de maíz.