Evaluación de un extracto de Kalanchoe flammea con acetato de etilo en los eventos biológicos neoplásicos del cáncer de próstata y su caracterización fitoquímica

Abstract

El cáncer es una enfermedad compleja que involucra la multiplicación descontrolada de las células y con capacidad de diseminarse a tejidos adyacentes (metástasis) en nuestro organismo. En la población masculina, el Cáncer de Pulmón ocupa el primer lugar de incidencia y mortalidad, seguido por el Cáncer de Próstata. El estudio de la bioactividad de los productos naturales ha sido relevante en la química medicinal ya que han sido utilizados como referencia para la síntesis de principios activos en algunos fármacos comercializados en la actualidad. También, los compuestos obtenidos de productos naturales han jugado un papel importante para el tratamiento del cáncer, del cual se han derivado fármacos utilizados en la quimioterapia (Paclitaxel, Camptotencina y Vincristina, entre otros). El Cáncer de Próstata es una enfermedad de lento crecimiento, caracterizado por un desbalance entre la división y muerte celular. La falta de muerte celular programada (apoptosis) representa el principal factor de acumulación gradual de células neoplásicas en la próstata; a su vez, la apoptosis también está asociada al proceso de progresión de cáncer localizado de condición hormonodependiente hacia un estado metastásico de condición hormono-independiente. Considerando esto, un fármaco anticancerígeno ideal, sería aquel que destruya las células cancerosas sin causar un daño excesivo en células normales, situación que es lograda a través de la inducción de la apoptosis en células cancerosas. Antecedentes relacionados al género Kalanchoe (Crassulaceae) indican que posee metabolitos (Glucósidos cardiotónicos, Alcaloides, entre otros) con actividad biológica en diversas líneas celulares de cáncer. Kalanchoe flammea es una planta utilizada en la Medicina Tradicional Mexicana para tratar diferentes enfermedades, incluyendo el cáncer. Con base en esto, un extracto con acetato de etilo de K. flammea (KfAcOEt) fue analizada en cuanto a su actividad biológica (in vitro e in vivo) en células de adenocarcinoma prostático (PC3) de condición hormono-independiente y en células de epitelio prostático (PrEC) como control de células no cancerosas, así como en linfocitos de sangre periférica. En los ensayos de citotoxicidad, la viabilidad celular de ambas líneas celulares disminuyeron de manera dosis-respuesta, presentando cierto índice de selectividad sobre las células neoplásicas. La concentración inhibitoria media fue de 1.361 ± 1.14 μg/mL (PC3) y 127.0 ± 1.19 (PrEC), y en contraste, no se observó efecto citotóxico en Linfocitos de sangre periférica. De las fracciones obtenidas en el ensayo bio-dirigido, KF8-3 fue la fracción con mayor actividad en células PC3 (1.057 ± 0.06 μg/mL), manteniendo su selectividad hacía células neoplásicas. De acuerdo a las recomendaciones del Comité de Nomenclatura de Muerte Celular, se realizaron las pruebas necesarias para caracterizar el efecto apoptótico inducido por el extracto KfAcOEt en las células PC3. El extracto KfAcOEt evaluado a la concentración inhibitoria al 50% mostró un efecto de sobreproducción de especies reactivas de oxígeno como parte del evento de inicio de la apoptosis, desde las 6 h de exposición al extracto. También se determinó la liberación de Citocromo C de la mitocondria al citosol y la activación de Caspasa-3 desde las 12 h de tratamiento, estos últimos eventos bioquímicos claves en la activación de la vía intrínseca de la apoptosis. Aún cuando la participación de Bcl-2 es importante, no se encontraron cambios en los niveles de expresión de esta proteína. Finalmente, las células expuestas al extracto KfAcOEt, resultaron positivas a la prueba de TUNEL, la cual nos indica fragmentación del ADN como evento final de la apoptosis, en los cuales también fueron observados los cambios dinámicos de la membrana plasmática y la pérdida de la morfología celular relacionados al encogimiento celular observado. En el análisis del ciclo celular que se realizó, las células PC3 tratadas con el extracto KfAcOEt mostraron arresto celular en la fase de Síntesis a las 12 y 24 h de exposición. También este efecto fue observado a las 24 h en células PC3 tratadas con la fracción citotóxicamente activa KF8-3. En relación a los ensayos In vivo realizados, el extracto KfAcOEt mostró actividad inhibitoria del crecimiento tumoral y ninguno de los ratones perdió peso como indicativo de un efecto tóxico, el cual fue confirmado al hacer el análisis histológico de los principales órganos extraídos (Hígado, Bazo y Riñon). El ensayo de Micronúcleos se realizó con la finalidad de comprobar si el extracto KfAcOEt era capaz de ejercer un daño genotóxico, resultando negativo a la formación de micronúcleos en Reticulocitos y Eritrocitos, con la dosis administrada de1000 mg/kg a los ratones. También se evaluó la Dosis Letal Media, asignando al extracto KfAcOEt en la categoría 5 (DL50>5000 mg/kg) de la OECD en los ratones evaluados, es decir extracto “seguro”. Finalmente, algunos compuestos de las fracciones secundarias fueron separados por cromatografía en placa preparativa e identificados cualitativamente mediante espectrometría de masas por impacto electrónico. Los resultados obtenidos fueron comparados con una base de datos que indicó la presencia de alcaloides, esteroles y glucósidos cardiotónicos. De la fracción KF8-3 obtenida, que resultó citotóxica en las células PC3, se separaron algunos compuestos mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y se obtuvieron tres compuestos; dos de éstos compuestos mayoritarios se analizaron por resonancia magnética nuclear de protones para la elucidación de su estructura molecular, estos datos se compararon con referencias de compuestos obtenidos de otras especies de Kalanchoe; sin embargo, no corresponden a los ya reportados en la literatura, por lo tanto es posible que sean compuestos aún no descritos a los cuales se le están realizando otras pruebas para identificarlos.