Análisis funcional y molecular del factor de corte EhCFIm25 de Entamoeba histolytica como blanco terapéutico en la amibiasis humana

Abstract

La poliadenilación de los 3’UTR de los ARN mensajeros es un importante regulador de la expresión génica en células eucariotas. En nuestra búsqueda de nuevos mecanismos para el tratamiento de la amibiasis humana causada por el protozoario Entamoeba histolytica, analizamos si la alteración de la poliadenilación representa una estrategia eficiente para el control del parasito, usando herramientas de biología molecular y computacional. Primeramente, realizamos el silenciamiento del factor de corte EhCFIm25 mediante el cultivo de los trofozoítos en presencia de RNA de doble cadena dirigidos contra el gen EhCFIm25. Los resultados evidenciaron que la ausencia de EhCFIm25 provoca la muerte de los parásitos y la disminución de sus propiedades de virulencia; además los trofozoítos aparecieron más grandes y multinucleados. Estos cambios fueron asociados a cambios en la selección del sitio proximal de corte/poliadenilación lo que probablemente repercutió en la expresión génica. Por otra parte, siguiendo la estrategia SELEX, identificamos dos aptámeros de ARN de cadena sencilla (C4 y C5) que reconocen específicamente a la proteína EhCFIm25. Ensayos de interacción RNA-proteína mostraron que EhCFIm25 se une al motivo GUUG in vitro, el cual difiere del motivo UGUA reconocido por la proteína homóloga humana. Consiguientemente, los experimentos de docking y simulaciones de dinámica molecular confirmaron que la interacción con GUUG estabiliza la proteína EhCFIm25, pero no la mutante EhCFIm25*L135T que no es reconocida por los aptámeros. Además, sugieren que la cadena lateral de Leu135 es esencial para el equilibrio estructural, mientras que el grupo hidroxilo del Tyr236 participa directamente en la interacción con el RNA. De manera interesante, el secuestro de EhCFIm25 por los aptámeros resultó en la muerte rápida de los trofozoítos. En conjunto, nuestros datos indican que la alteración de la poliadenilación y más específicamente del factor de corte EhCFIm25 representa una vía efectiva para el control de E. histolytica. Además, el presente estudio es el primero que remarca el valor potencial de los aptámeros de ARN para controlar este patógeno humano.