Clonación, sobrexpresión y análisis de la estructura de la enzima enolasa de Helicobacter pylori

Abstract

La enolasa es una enzima que participa en la vía clásica de la glucólisis de las células; esta enzima cataliza la conversión de 2-fosfo-D-glicerato en fosfoenolpiruvato. La enolasa es una enzima altamente conservada en todos los organismos, desde bacterias hasta humanos, lo que es un indicio de su importancia en las células. Aunado a esto, en la última década, se han descrito nuevas funciones para esta enzima, lo que ha llevado a que sea considerada como una proteína “moonlighting”, con más de una función. Helicobacter pylori es un patógeno humano común que causa enfermedades gástricas, incluso cáncer gástrico, sin embargo, la función de la enolasa de H. pylori (hpENO) no ha sido descrita en lo absoluto. En el presente proyecto se llevó a cabo un análisis de secuencia, estructural y bioquímico de la hpENO. El análisis de la secuencia de la hpENO; muestra la conservación de los sitios importantes para la catálisis (sitio activo, sitio de unión del substrato y sitios de unión del cofactor), indicando que la hpEno debería ser capaz de llevar a cabo su función glucolitica. La enzima recombinante hpENO se sobreexpresó en E. coli Rosetta-gami y se purificó a partir de cuerpos de inclusión. En el análisis de estructura secundaria y terciaria de la hpENO los resultados (espectros de DC-UV lejano y de fluorescencia, obtenidos en tres soluciones buffer distintas: tris-acetatos, tris-HCl y fosfato de postasio, cada uno complementando) exponen algunas sutiles diferencias en las lecturas de MRW y de intensidad de fluorescencia respectivamente de la apo y holo-hpENO en los tres tampones; sin embargo, en general podemos indicar que la hpENO reveló espectros característicos de una proteína plegada (con estructura secundaria y terciaria), similares a los espectros reportados para las enolasa de otras especies. Asimismo, la hpENO mostró diferentes perfiles de desplegamiento térmico y de efecto estabilizador de su cofactor propios de cada tampón. Adicionalmente, estudiamos la cinética de la reacción de desplegamiento y calculamos la entalpía de activación para la hpENO. En la comparación de la hpENO con las enolasa de otras especies, la hpENO muestra características similares de estructura secundaria y terciaria, así como de la reacción de LLMJ plegamiento/desplegamiento. Particularmente la entalpía de activación asociada con la reacción de desplegamiento térmico, cuyo valor para la hpENO fue muy similar a la de la enolasa de levadura, lo que sugiere que estas comparten un camino de plegamiento similar y estabilidad cinética. Sin embargo, aún bajo un gran número de condiciones experimentales evaluadas, la actividad enzimática de hpENO no pudo detectarse, lo que implica que esta proteína no tiene una función glucolítica en H. pylori. Este hallazgo es consistente con los experimentos previos sobre la oxidación de la glucosa a través de la vía Entner-Doudoroff y la ausencia en el genoma de un conjunto de enzimas necesarias para la glucólisis. Los resultados revelan nuevas características de hpENO.