Microcosm evaluation and metagenomic analysis of the bioremediation of soils contaminated with pahs by microbial consortia

Abstract

Esta tesis se enfoca en el uso de consorcios microbianos mixtos conformados por microorganismos nativos y genéticamente modificados (GEMs) en la biorremediación de suelos contaminados con Hidrocarburos Aromáticos Policíclicos (PAHs). Para ello se evaluaron las condiciones óptimas para la biorremediación de suelos mediante las técnicas de bioestimulación y bioaumentación, teniendo en cuenta las interacciones y efectos producidos entre la microbiota propia del suelo y los consorcios inoculados por medio de análisis metagenómicos. En el Capítulo 2 se describe la obtención, identificación y selección de aislados bacterianos y fúngicos altamente tolerantes a PAHs, capaces de degradar PAHs de bajo (LMW) y alto peso molecular (HMW). Un total de 50 aislados fueron identificados y evaluados para conocer su potencial de tolerar concentraciones elevadas de fenantreno (Phe), pireno (Pyr) y benzo[a]pireno (BaP). Trichoderma asperellum H15, Aspergillus nomius H7, Aspergillus flavus H6, Pseudomonas aeruginosa B7, Klebsiella sp. B10 y Stenotrophomonas maltophilia B14 se mostraron capaces de utilizar PAHs como única fuente de carbono y presentaron niveles notablemente altos de tolerancia, de hasta 6,000 mg L . Se construyó un consorcio microbiano conformado por 12 cepas fúngicas/bacterianas tolerantes para la biorremediación de un suelo contaminado con PAHs, consiguiendo una degradación de 87.76% de Phe, 48.18% de Pyr y 56.55 % de BaP. Este fue el primer estudio en donde se evaluó la tolerancia microbiana a concentraciones extremas de PAHs, resultando en un consorcio degradador y altamente tolerante con la capacidad de utilizar PAHs como única fuente de carbono. En el Capítulo 3 se evaluó la capacidad de Trichoderma asperellum H15, la cepa que mostró los niveles más altos de tolerancia, para degradar PAHs en suelos junto con un tratamiento de bioestimulación utilizando bagazo de caña. T. asperellum H15 se adaptó rápidamente a los suelos contaminados con PAHs, degradando hasta 74% de Phe, 63% de Pyr y 81% de BaP después de 14 días. Se encontró que las actividades enzimáticas de tipo catecol 1,2-dioxigenasa, lacasa y peroxidasa están directamente involucradas en el proceso de degradación por este microorganismo. Los resultados demostraron el alto potencial de T. asperellum para ser usado por si solo en un proceso de biorremediación de suelos. Este es el primer estudio en el que se describe el papel de T. asperellum en la degradación de LMW y HMW PAHs. En el Capítulo 4 se evaluó el efecto de los PAHs sobre el crecimiento, morfología y capacidad de esporulación de dos cepas fúngicas degradadoras. La presencia de altas concentraciones de PAHs produjeron efectos significativamente perjudiciales sobre el crecimiento radial de A. nomius H7, así como cambios en la pigmentación del micelio y la abundancia y capacidad de esporulación. En contraste, el crecimiento de T. asperellum H15 no se vio afectado aunque la capacidad de esporular se presentó únicamente hasta 4000 mg L−1 y se presentaron cambios en los patrones de esporulación y pigmentación del micelio. Los resultados sugieren que los PAHs podrían desencadenar modificaciones importantes de la membrana celular y mecanismos de defensa involucrados en la producción de pigmentos, así como afectar las vías centrales de esporulación y producir un retraso en el proceso de esporulación. En el Capítulo 5 se construyeron consorcios microbianos degradadores mejorados utilizando un método de selección inducida. Para la construcción de los consorcios se utilizaron cepas bacterianas y fúngicas nativas, además de dos cepas GEM de A. niger expresando los genes LiP y MnP de P. chrysosporium. Después de una selección inicial utilizando pruebas de antagonismo microbiano, el proceso de selección fue llevado a cabo a nivel microcosmos utilizando un suelo estéril contaminado con una mezcla de PAHs y monitoreando la supervivencia o desaparición de cada cepa por PCR-DGGE. Como resultado se conformaron dos consorcios degradadores denominados C1 (conformado por cepas nativas) y C2 (conformado por cepas nativas y GEM), capaces de degradar hasta 91% de Phe, 64.2% de Pyr y 64.9% de BaP después de dos semanas de tratamiento. Los resultados mostraron que ambos consorcios poseen un alto potencial para la biodegradación de PAHs debido a su alta tolerancia hacia compuestos aromáticos, su capacidad de utilizar los contaminantes como fuente de carbono y al proceso de selección utilizado. Posteriormente en el Capítulo 6 se establecieron las condiciones óptimas para la degradación de PAHs en suelos mediante la bioaumentación con los dos consorcios y bioestimulación con bagazo de caña y residuos de maíz. Los ensayos se llevaron a cabo utilizando suelos estériles contaminados con 2000 mg Kg-1 de una mezcla de Phe, Pyr y BaP. Las condiciones óptimas para la degradación consistieron en 30% de humedad relativa y una relación de suelo/residuo agroindustrial de 95:5. Los valores más altos de degradación se consiguieron con el consorcio C2, residuos de maíz al 5% y una humedad relativa de 30%, alcanzando una degradación de 96.25% de Phe, 80.47% de Pyr y 71.15% de BaP después de 30 días. El consorcio C1 produjo resultados comparables con aquellos del consorcio C2. Los perfiles de DGGE mostraron que la mayoría de los microorganismos permanecieron hasta el final del proceso. Por último, en el Capítulo 7 se realizó un estudio metagenómico para analizar algunos de los efectos producidos entre la microbiota nativa y los consorcios degradadores durante la biorremediación de un suelo contaminado con PAHs, proporcionando información con respecto a las vías metabólicas y enzimas específicas involucradas en el proceso. La bioaumentación y bioestimulación produjo cambios apreciables en la diversidad microbiana de los suelos, desplazando algunas comunidades microbianas en favor de las poblaciones degradadoras de PAHs. El análisis funcional sugirió un direccionamiento del metabolismo hacia las vías de degradación de compuestos aromáticos y de intermediarios tales como el salicilato, protocatecuato, gentisato y benzoato, favoreciendo la mineralización de los PAHs. La abundancia de genes implicados en el catabolismo de PAHs vía citocromo P450 se encontró significativamente reducida en los suelos inoculados, indicando una probable reducción de la formación de intermediarios tóxicos. La degradación de los PAHs se produjo de manera más rápida y alcanzó niveles más elevados que reportes previos utilizando condiciones similares, como consecuencia de una degradación cometabólica y sinérgica. Se encontraron diferencias significativas en la abundancia de diversos genes de dioxigenasas, lacasa y descarboxilasas. Con base en los resultados fue posible proponer varias de las vías de degradación de PAHs que potencialmente tienen lugar en el suelo durante el proceso de biorremediación.